I begyndelsen af 2000'erne blev Mikkelsen kendt af hele Danmark gennem tv-serien 'Rejseholdet' og film som 'Blinkende Lygter' og 'De grønne slagtere'. Hans evne til at skifte mellem humor og alvor gjorde ham til en af landets mest alsidige skuespillere.
Det store internationale gennembrud kom i 2006, da han spillede skurken Le Chiffre i James Bond-filmen 'Casino Royale'. Siden fulgte roller i tv-serien 'Hannibal', i Marvel-filmen 'Doctor Strange' og i 'Indiana Jones and the Dial of Destiny'. I 2012 vandt han prisen for bedste mandlige skuespiller ved filmfestivalen i Cannes for 'Jagten'. Og i 2021 vandt 'Druk', hvor han spiller hovedrollen, en Oscar for bedste internationale film.